Mikrobiom tla i metagenomika — 16S rRNA sekvenciranje i procena zdravlja tla

U jednoj kašičici zdravog tla živi između jedne i deset milijardi mikroorganizama, koji zajedno reprezentuju između 10.000 i 50.000 različitih vrsta — koncentracija biološke raznolikosti koja premašuje sve što vidimo na površini tla i koja je, do pre tridesetak godina, bila potpuno nedostupna direktnom proučavanju. Kultura mikroorganizama iz tla na hranjivim podlogama — metoda koja je bila jedini dostupni pristup tokom većeg dela 20. veka — u stanju je da kultivishe manje od 1% mikroorganizama prisutnih u tlu, jer su ostali obligatni simbionti ili imaju zahteve za rastom koji ne možemo replicirati u laboratoriji.

Revolucija u razumevanju mikrobnog sveta tla nastupila je razvojem molekularnih metoda — pre svega sekvenciranjem DNK direktno ekstrahovanog iz uzorka tla bez prethodne kultivacije — što je pokrenulo čitavu novu naučnu disciplinu: metagenomiku tla. Ove metode, u kombinaciji s bioinformatičkim alatima za analizu ogromnih skupova podataka koji nastaju modernim sekvencioniranjem visoke propustnosti (Next-Generation Sequencing, NGS), omogućile su nam da za prvi put vidimo potpunost mikrobne zajednice tla i da je povežemo s ekosistemskim funkcijama koje tlo obavlja.

Za studenta ekologije ili zaštite životne sredine, razumevanje osnova mikrobne ekologije tla i metagenomskih metoda nije više luksuz rezervisan za specijalizovane mikrobiologe — to je kompetencija koja postaje relevantna u kontekstu procene zdravlja tla, agrikulturnih inovacija, klimatske nauke (tlo kao ugljikova banka) i bioremedijacije. Za širi pregled ove teme pogledajte i hub Zemljište.

16S rRNA sekvenciranje: taksonomska inventarizacija mikrobne zajednice

Gen koji kodira 16S ribozomnu RNK (rRNK) u prokariota — bakterija i arhea — zlatni je standard za taksonomsku identifikaciju mikroorganizama bez kultivacije. Ovaj gen je idealan filogenetski marker iz više razloga: prisutan je u svim prokariontima, dovoljno je konzerviran da omogući dizajn univerzalnih prajmera koji amplifikuju gen iz svakog prokarionta bez obzira na vrstu, ali sadrži i dovoljno varijabilnih regiona (posebno regioni V3, V4 i V6) koji su taksonomski dijagnostički na nivou roda i ponekad vrste.

Metabarkoding protokol na osnovu 16S rRNK uključuje: (1) Ekstrakciju totalne DNK iz uzorka tla — ključan korak jer metode ekstrakcije selektivno favorizuju različite grupe mikroorganizama i moraju biti standardizovane za komparirane studije; (2) PCR amplifikaciju varijabilnih regiona 16S gena sa florescentno obeleženim prajmerima koji se razlikuju između uzoraka (multipleksing); (3) Biblioteku pripremu i sekvenciranje na Illumina platformi (najčešće MiSeq ili NovaSeq) koji daju milione kratkih čitanja po uzorku; (4) Bioinformatičku analizu: trimovanje adaptora, spajanje paired-end čitanja, filtracija kvaliteta, grupiranje u OTU (Operativne Taksonomske Jedinice) ili ASV (Amplicon Sequence Variants) i taksonomska anotacija kroz SILVA ili NCBI bazu.

Callahan i saradnici (2016, Nature Methods) razvili su DADA2 — bioinformatički paket koji je revolucionisao analizu amplikon sekvenci time što generiše ASV umesto OTU. ASV su tačne sekvence, slobodne od grešaka sekvenciranja, i time se mogu porediti između studija bez zavisnosti od arbitrarnog praga OTU sličnosti (koji je tipično bio 97%). Prelaz sa OTU na ASV metodologiju poboljšao je reproducibilnost i kompariabilnost 16S studija, ali zahteva razumevanje bioinformatičke osnove da bi se interpretirale razlike između starijih i novijih studija.

Funkcionalna metagenomika: geni koji govore o procesima

16S sekvenciranje nam govori ko je prisutan u mikrobnoj zajednici (taksonomski profil), ali ne direktno šta ta zajednica radi — koje biogeohemijske funkcije obavlja. Za funkcionalno razumevanje mikrobne zajednice tla, primenjuju se pristupi koji sekvenciraju celokupan genetski materijal uzorka (shotgun metagenomika) ili targetiraju specifične funkcionalne gene.

Shotgun metagenomika (whole-genome shotgun sequencing, WGS) fragmentiše i sekvencira svu DNK iz uzorka, dajući uvid u pun funkcionalni kapacitet zajednice kroz anotaciju sekvenci prema funkcionalnim bazama podataka (COG — Clusters of Orthologous Groups, KEGG — Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes). WGS je informativan ali skup i computationally intenzivan — duboka pokrivenost potrebna za detekciju retkih funkcionalnih gena iziskuje desetke do stotine miliona čitanja po uzorku.

Targetovano sekvenciranje funkcionalnih markera — gena koji kodiraju ključne enzime u biogeohemijskim ciklusima — efikasnija je alternativa za specifična istraživačka pitanja. Na primer: nifH gen kodira dinitrogenazu reduktazu, ključni enzim fiksacije azota i marker za N-fiksatorne bakterije; amoA gen kodira amonijev monooksigenazu i marker je za nitrifikatore; dsrA/B genovi kodiraju disulfitnu reduktazu i markeri su za sulfat-redukujuće bakterije. Sekvenciranje ovih amplifikona iz metagenomskog uzorka direktno karakteriše funkcionalni kapacitet zajednice za specifičan biogeohemijski proces. Za srodnu biogeohemijsku temu pogledajte tekst o ciklusu azota u uslovima klimatskih promena.

Bálint i saradnici (2016, Science) analizirali su globalnu distribuciju mikrobne raznolikosti tla i zaključili da taksonomska raznolikost mikrobnih zajednica opada prema višim geografskim širinama — obrazac suprotan od onoga koji vidimo kod biljaka i životinja. Klimatski gradijenti (temperatura, vlažnost) i hemijske karakteristike tla (pH, sadržaj organske materije) su najjači prediktori mikrobne raznolikosti — pH tla posebno snažan prediktor koji objašnjava više varijanse u mikrobnoj zajednici nego geografska distanca.

Primena u proceni zdravlja tla: od sekvence do indeksa

Razumevanje mikrobne zajednice tla sada se aktivno koristi u razvoju indeksa zdravlja tla koji bi bili primenljivi u monitoringu i agrikulturnoj savetodavnosti. Ideja je atraktivna: ako je mikrobna zajednica tla direktno odgovorna za ključne ekosistemske funkcije (razgradnja organske materije, cikling nutrijenata, supresija bolesti biljaka), promene u strukturi te zajednice trebale bi biti rani signal degradacije ili poboljšanja zdravlja tla — potencijalno pre nego što su promene vidljive u konvencionalnim hemijsko-fizičkim pokazateljima.

Nannipieri i saradnici (2017, Applied Soil Ecology) pregledali su pristupe za definisanje mikrobnih indikatora zdravlja tla i zaključili da nijedan pojedinačni mikrobiološki parametar (biomasa, respiracija, enzimska aktivnost, raznolikost) nije sam po sebi dovoljan za sveobuhvatnu procenu — ali kombinovani, sveobuhvatni mikrobni profil (koji obuhvata taksonomski i funkcionalni aspekt) ima potencijal da bude najosetljiviji i najintegrisaniji dostupni indikator zdravlja tla.

Praktična primena metagenomike u proceni zdravlja tla u srpskom kontekstu tek je u začetku. Nekoliko istraživačkih projekata finansovanih od strane MNTR-a i EU fondova karakterizovalo je mikrobiom specifičnih tipova tla (vojvođanski černozem, planinska tla), ali sistematski, dugoročni program koji bi pratio dinamiku mikrobnih zajednica u zavisnosti od agrikulturnih praksi na reprezentativnim parcelama ne postoji. Uspostavljanje takvog programa — analognog britanskom Countryside Survey Soil koji prati mikrobiom tla od 2000-ih — bio bi naučni i politički prioritet koji bi direktno podržao formulisanje agro-ekoloških politika zasnovanih na dokazima. Dobar nastavak je i priča o dinamici organskog ugljenika u tlu.

Za studente koji ulaze u ovu oblast, bioinformatičke kompetencije su jednako važne kao laboratorijske: vladanje R paketima (phyloseq, vegan, DESeq2) za analizu amplikon sekvenci, Linux komandnom linijom za metagenomske pipeline (QIIME2, mothur), i razumevanje statističkih metoda za analizu zajednica (ordination, permanova, alpha i beta diverzitetne metrike) — ovo je kompetencijski set koji tržište rada u agrikulturnoj ekologiji, bioremed džijaciji i kliničkoj ekologiji aktivno traži.